План

1.      Коротка історія проблеми.

2.      Теоретичні передумови трансплантації ембріонів.

3.       Практика відбору донорів і реципієнтів.

4.      Гормональна регуляція овогенезу і поліовуляцій.

5.      Синхронізація фізіологічного стану статевої системи донора і реципієнти.

6.      Практика вимивання і пересадки ембріонів.

7.      Техніка роботи з ембріонами.

8.      Стан трансплантації ембріонів у тваринництві.

Трансплантація від пізньолатинського означає "пересаджую".

Трансплантація у людини і тварин - це пересадка органів, тканин (серця, нирок, печінки, шкіри тощо). Як хірургічний метод трансплантація відома з глибокої давнини. Нині в медицині широко застосовується трансплантація шкіри, крові, м'язів, сухожиль, вен, нервів, роговиці ока, жирової і кісткової тканин, серця, нирок, печінки тощо. Особливий вид трансплантації є переливання крові.

У біології і клінічній медицині застосовують: ауто-трансплантацію - трансплантацію власних тканин у межах організму; алло- або гомотрансплантацію - трансплантацію в межах виду від донора до реціпієнта; гетеро- або ксено-трансплантацію -трансплантація міжвидова від донора одного виду до рещпієнта іншого виду, наприклад, людині від тварин, собаці від кролів тощо. Щеплення у садівництві не що інше, як гомо- і гетеро­трансплантація. Нині трансплантацію застосовують для створення організмів-химер.

Нині трансплантація є ефективним методом створення високопродуктивних стад сільськогосподарських тварин. Використовуючи трансплантацію зигот від високопродуктивних корів протягом року можна одержувати понад 60 телят. У СІЛА цим методом одержують від 100 до 500 тисяч телят щорічно. Виробничим методом стала трансплантація зигот у тваринництві ряду європейських країн. Трансплантація ембріонів у тваринництіїї дозволяє підвищити рівень інтенсивності використання видатних маток, інтенсифікувати використання їх генетичного потенціалу, як штучне осіменіння забезпечує підвищення інтенсивності використання цінних плідників, їх генетичних ресурсів. Трансплантація ембріонів є біотехнічним методом інтенсифікації відтворення високопродуктивних тварин.

1. Коротка історія проблеми

Як метод наукового дослідження трансплантацію широко використовував англійський вчений Дж. Евелін з 1662 року. Як клінічний метод у медицині трансплантацію з 1835 року застосовував М.І. Пирогов при кістковопластичних операціях. У 1869 році французький лікар Ж. Реверден здійснив трансплантацію шкіри. У 1902 році французькій хірург здійснив трансплантацію судин. У 1906 році А.Ф. Шамановський здійснив пересадку переднього відділу ока (рінопластика). У1908 році російський хірург П.І. Бухман провів пересадку суглобів. У1924 році С.С.Брюхоненко розробив штучний апарат кровообігу. Вперше в світовій практиці медицини пересадку життєво важливих органів (трупної нирки) у 1933 році здійснив український вчений Ю.Ю. Боровий.

Трансплантація зигот вперше була здійснена англійським вченим Хіппом у 1880 році на кролях. Понад 50 років цією проблемою займались Д. Деріво, Ф. Ектор. Але масштабні системні й всебічні дослідження трансплантації зигот ведуться з 40-50 років 20 століття.

Почесне місце серед дослідників трансплантації зигот у тваринництві належить українським і російським вченим О.В.Квасницькому, М.К Кольцову, П.І. Сергеєву, А.К.Голубєву, О.Д. Вугрову, В.В. Медісон, Л.В. Медісон та іншим. У 1929-1944 роках М.М. Завадовським був розроблений метод гормональної стимуляції двойневості у корів, багатопліддя у каракульських овець. Цей метод стимуляції поліовуляції на яєчниках тварин використовується до нашого часу. У ці ж роки М.К. Кольцовим, О.В. Квасницьким, М.М. Завадовським було виявлено, що при зростанні поліовуляції зростає відсоток ембріональної смертності й абортів.

Дж. Сринан (1975), Л. Роусон (1969), Г. Андерсон (1976) розробили і впровадили в практику методику трансплантації зигот в кожний ріг і одержання 45-75% двійнят у корів, тоді, як за умови природного парування їх одержують 1-1,5%.

М. Чанг у 1947 році перший повідомив про розвиток трансплантованих кроленят у рецепієнтів після зберігання ембріонів при температурі 5-10°С протягом 80-100 годин. У 1972 році Д. Віттингем одержав 29% прилсивлення трансплантантів після збереження ембріонів при температурі -196°С у рідкому азоті і одержав нормальний приплід. Р. Морер у 1976 році розробив свою методику зберігання зигот при томпз^^атурі 37°С в яйцепроводах гомогених і гетерогенних самок. Ця методика забезпечує збереження ембріонів корів до 8 бластомерів і мор/ли до 7іі-96 годин.

Трансплантація ембріонів повинна стати досконалим, ефективним, досить простим і доступним для тваринників біотехнічним методом, у поєднанні зі штучним осіменінням трансплантація ембріонів становить основу сучасної найбільш прогресивної технології відтворення високоцінних племінних тварин. Трансплантація ембріонів є ефективною тільки при використанні генетично цінних тварип, високопродуктивних, перевірених за якістю потомства.

2. Теоретичні передумови трансплантації ембріонів

В усі часи розвитку суспільства людина звертає свої погляди на форми прояву життя, і зокрема, на такий його феномен, як розмноження та різноманіття форм його реалізації. Нині накопичено досить багато знань про поділ клітин, відпочкування, вегетативне і статеве розмноження в світі рослин і тварин. Якщо звернути погляди в глибину історії еволюційних процесів як у світі рослин, так і тварин, то чітко спостерігається, що природа виробила і широко використовує способи збереження запліднених яйцеклітин іп уііго при статевому розмноженні, наприклад, у рептилій, птахів.

Природа демонструє приклади нехірургічного і абсолютно нешкідливого для організму самки виведення яйцеклітин і їх запліднення іп уііго (риби). Ще більше таких прикладів зустрічається в світі рослин. Бджоли та інші комахи здійснюють штучне осіменіння в рослинництві. Це навіяло роздуми людини, а чи не можна штучне осіменіння використовувати у тваринництві. Вивчення і пізнання цих процесів дозволило одержати знання, які стали корисними для розробки технології трансплантації ембріонів сільськогосподарських тварин.

Вивчення запліднення і розвитку запліднених яйцеклітин, показує, що більшою самостійністю, незалежністю від материнського організму володіють ті яйцеклітини, у яких єдостатній запас поживних речовин (наприклад, у вигляді жовткових зерен) у межах цитоплазми, або ті, які порівняно легко можуть переходити до стану анабіозу під впливом фізичних і хімічних факторів. Яйцеклітини сільськогосподарських ссавців (рогата худоба, коні, свині тощо) відносяться до маложовткових. Це слід мати перш за все на увазі при розробці технології трансплантації, і здійснювати наступне: забезпечення заплідненої клітини живленням у залежності від стадії її розвитку іп уіііго; захистити зиготу від впливу факторів навколишнього середовища (температура, світло, рН, тощо); захистити зиготи від інтоксикації; профілактувати травмування зиготи при вимиванні, технологічній обробці, зберіганні; розробити досконалі способи переведення зиготи до стану анабіозу.

Трансплантація зигот відкриває у скотарстві реальні можливості одержувати від однієї корови не 8-12 телят протягом життя, а до ста за рік. Це дозволяє одержувати більшу кількість потомства від високопродуктивних корів, підвищити багатопліддя за рахунок одночасної пересадки двох зигот і поділу бластомерів. Створюються умови для оцінки корів за якістю потомства. Трансплантація ембріонів підвищує ефективність і скорочує час по створенню високопродуктивних стад, розширює діапазон можливостей вивчення ембріональної смертності, причин, що її обумовлюють та розробки заходів профілактики. Трансплантація створює умови вивчення взаємовідношень ембріон-мати, мати-ембріон. Застосування методів консервування по тривалому зберіганню ембріонів іп уііго забезпечує умови збереження і раціонального використання генофонду.

Трансплантація зигот розглядається як засіб підвищення темпів відтворення стад і прискорення генетичного прогресу. Це є один із фундаментальних методів дослідження біології розмноження. Метод трансплантації дозволяє одержувати об'єктивну і конкретну інформацію фізіології, біохімії, генетики, імунології відтворення. Впровадження трансплантації ембріонів у практику тваринництва сприяє наступному: одержанню еталонних тварин; вивченню ранніх етапів ембріогенезу; взаємодію генотипу і середовища; вплив організму реципієнта на реалізацію генотипу трансплантанта; удосконаленню техніки одержання двоєн за рахунок розщеплення бластомерів ембріона; розробці методів вимивання, відшукуванню, оцінці якості і консервуванню ембріонів; удосконаленню техніки трансплантації; вивченню факторів, що впливають на переживання і нідацію (приживлення) ембріонів у матці реціпієнта; розвитку нової галузі науки - імунології розмноження; розгортанню досліджень виділення, клонування, трансплантації тих чи інших генів, утворення химер; розробці імунологічних і цитогенетичних методів визначення статі ембріонів; розробці методики розділення ранніх ембріонів (отримання деми-ембріонів) і одержання ідентичних двійневих телят; вивченню запліднення яйцеклітин ссавців іп уііго; розширенню впливу на яйцеклітини фітоестрогенів (наприклад люцерни, конюшини тощо); вивчення проблеми толерантності, одержання толерантних зигот, стійких до різних умов, розробляти методи одержання толерантних організмів.

З 1945 року досить інтенсивно розвивається транспланта­ційна імунологія, що вивчає реакції організму при пересадці органів, тканин, ембріонів. Вже встановлено наявність імунної системи, що включає центральні і периферійні органи імунітету, виявлені первинні і вторинні порушення імунітету, ефективно розвивається алергієлогія, розрізняють теоретичну, клінічну, практичну, космічну імунологію. Все це забезпечує теоретичні передумови розвитку трансплантації ембріонів у тваринництві.

3. Практика відбору донорів і реципієнтів

Трансплантація як зоотехнічний метод включає наступне: роботу   з   донорами   і   реципієнтами;   вимивання,   оцінку   і консервування ембріонів; введення ембріонів у геніталії реципієнта тощо. Донори - це тварини парувального віку, високої племінної цінності, які після гормонально викликаної поліовуляції і осіменінні спермою видатних плідників-поліпшувачів, використовуються для одержання ембріонів. А реципієнти - це тварини, яким трансплантують (пересаджують) цінні ембріони донорів для їх подальшого розвитку. Реципієнти племінною цінністю значно поступаються донорам.

Трансплантація ембріонів як біотехнологічний метод включає наступне: відбір донорів, молочна продуктивність яких має бути на50-60% перевищувати показники стандарту для конкретної породи; гормональну регуляцію поліовуляції; техніку вимивання ембріонів (хірургічну, нехірургічну); збереження ембріонів іп уііго і оцінка їх якості (наприклад, волюмометричним способом, з допомогою якого можна чітко визначити цілісність мембранного апарату бластомерів, що значно підвищує точність оцінки якості ембріона); підбір реципієнтів; гормональну синхронізацію стану статевої системи реципієнтів зі статевою системою донора; годівлю і утримання реципієнтів; імунологічний контроль за вірогідністю походження трансплантантів; вирощування телят-трансплантантів з врахуванням того, що вони мають особливо високу вартість.

Для донорів цілеспрямовано відбирають високопродуктивних племінних тварин, з добре вираженою відтворною функцією, здорових, віком 14 і старше місяців. Необхідно, щоб донори добре реагували на гормональну обробку. А якщо для донорів відбирають корів, то бажано, щоб у них було 2 нормальних отелення протягом трьох останніх років. У донорів не повинно бути маститів, ендометритів, вагінітів, порушень обміну речовин. Після отелення проміжок часу має бути 2,5-3 місяці, оскільки перед використанням корів як донорів повинно відбутися два статеві цикли. Перед гормональною обробкою донорів ретельно обстежують на наявність жовтих тіл і фолікулів в яєчниках. Гіпофункція яєчників знижує ефективність обробок. У донорів досліджують кров чи молоко на прогестерон. При відборі донорів віддають перевагу тим, від яких уже були одержані видатні тварини.

При відборі донорів необхідно враховувати не тільки показники продуктивності, але і тип тварини за комплексом селекційних ознак, що особливо важливо для одержання від них високопродуктивних плідників-поліпшувачів. Наприклад, корів-донорів відбирають зі стада, що має відносно високий рівень молочної продуктивності, характерний для конкретної породи. Вони повинні мати відоме походження і групу крові, що підтверджуються відповідними документами.

Молочна продуктивність корів-донорів протягом ряду років має бути в середньому на 50-60% вищою за стандарт для породи, а вміст жиру і білку в молоці - на рівні або вищий стандарту. Перевагу надають коровам, від яких вже були одержані видатні або високоцінні нащадки.

За комплексом селекційних ознак корови-донори повинні відповідати вимогам класу еліта-рекорд. При відборі донорів особливу увагу звертають на форму вим'я, швидкість молоковіддачі. На молочних комплексах і фермах з промисловою технологією виробництва надають перевагу тваринам, які мали не менше трьох лактацій, зберегли нормальну функцію відтворення і стійки до технологічних стресів.

Корова-донор під час останнього отелення не повинна мати ускладнень (тяжке отелення, затримка посліду, післяродові захворювання статевих органів). Стан органів відтворення контролюють спеціалісти ветеринарної медицини шляхом ректального дослідження на 15-20-й день після отелення і наступних спостережень протягом півтора-двох статевих цикли. Корови з ненормальними статевими циклами, кистами яєчників до використання в якості донорів не допускаються.

Гормовальна стимуляція поліовуляцій у доіюрів допускається через 60 днів після отелення. За умови відсутності реакції на гормональну обробку тварину виключають з числа донорів.

У відборі донорів приймають участь фахівці ветеринарної медицини. На кожну тварину (або групу) оформляють ветеринарне свідоцтво, де відмічається етап здоров'я (за даними клінічних досліджень), благополучність господарства щодо захворюваньтварин бруцельозом, туберкульозом, вірусними респіраторними захворюваннями, трихомонозом, вібріозом, інфекційним пустульозним вульвовагінітом, ящуром та іншими захворюваннями, які передаються ембріону. У свідоцтві обов'язково вказують дату останнього діагностичного обстеження і обробки.

Штучне осіменіння донорів здійснюють у перший день статевої охоти і обов'язково повторюють через 12-24 години після першого.

Критерії відбору реципієнтів мають бути наступними: в якості реципієнтів можна використовувати як корів, так і телиць, які не представляють значної племінної цінності для господарства; при формуванні плану ембріопересадок необхідно враховувати вірогідність вибраковки 20-25% тварин-реципієнтів через непридатність до відтворення взагалі чи у конкретно намічені терміни пересадки; реципієнтів відбирають з телиць 16-18-місячного віку, живою масою 350-360 кг, племінна цінність яких нижча корів-донорів; реципієнти повинні бути клінічно здоровими з нормально розвинутими і функціонуючими статевими органами і вони повинні відповідати класу еліта та еліта-рекорд; годівля і утримання реципієнтів здійснюється за нормами і на рівні корів-донорів, до них пред'являють ті ж ветеринарні вимоги, що і до донорів; у цих тварин повинно здійснитись 2-3 нормальних статеві цикли; у реципієнтів реакція організму на обробку повинна бути такою, як і у донорів.

Синхронний прояв охоти у реципієнтів з донорами (тобто синхронність розвитку ембріона донора з диференціацією ендометрія у реципієнта) не повинна мати різницю більше 24 годин. Оптимальні результати нидації одержують коли ця різниця не перевищує 12 годин.

У первісток-трансплантантів і первісток одержаних традиційними методами не спостерігається різниці за хімічним складом молока, розвитком вим'я, відтворною функцією тощо.

4. Гормональна регуляція овогенезу і поліовуляції

Гормональний метод стимуляції поліовуляції у сільськогосподарських тварин, теоретичні основи якого були розроблені у 30-ті роки минулого століття групою вчених під керівництвом академіка М.М. Завадовського, до нині широко використовується в практиці тваринництва. У більшості випадків поліовуляції викликають шляхом ін'єкцій гонадотропіну (СЖК) у поєднанні з простагландинами та іншими біологічно активними речовинами на 12-20-й день статевого циклу. Одним із недоліків цього способу є висока варіабільність кількості овуляцій, навіть при використанні однієї і тієї ж дози гонадотропіну.

Хороших наслідків суперовуляції можна чекати, коли до моменту обробки гонадотропіном в яєчниках тварин є тільки функціонуюче жовте тіло діаметром 1,5 см. При наявності на одному із яєчників розвинутого фолікула діаметром біля 10 мм рівень поліовуляції знижується і деш;о порушується нормальна овуляція. Індекс суперовуляції також знижується, якщо, окрім добре розвинутого жовтого тіла, на яєчнику є розвинутий фолікул, фолікулярна чи лютеїнова киста. Тому ефективність гормональної обробки значною мірою залежить від фізіологічного стану яєчників. Крім того, тварини мають не однакову чутливість до гонадотропіну. Відсоток тварин, які реагують поліовуляціями на введення екзогенного гонадотропіну, знаходиться в прямій залежності під дози препарату. Оптимальною дозою нативного препарату СЖК в 3000-3600 інтернаціональних одиниць, яка забезпечує в середньому дев'ять овуляцій на одного позитивного до поліовуляції донора. Зі збільшенням ДОЗИ С^КК спостерігається збільшення кількості фолікулів, які не овулють. Оптимальна кількість ліофізованих стандартних препаратів ГСЖК високого очищення (інтергонал, маротропін, фолігон, серогонадотропін тощо) є 2000-2500 інтернаціональних одиниць.

При індукуванні поліовуляції час введення гонадотропіну має значний вплив на рівень суперовуляції. Оптимальним терміном введення гонадотропіна є 10-12-й день естрального циклу.

На рівень індекса поліовуляції помітно впливає сезон року. Але при забезпеченні повноцінної і достатньої годівлі як за поживністю, так і за вітамінами, мікроелементами вплив сезону року можна звести до мінімума.

Для стимуляції поліовуляції застосовують декілька схем гормональної обробки.