Технологія розрідження, зберігання, транспортування сперми
План
- Значення розведення спермии, загальні вимоги до розріджувачів.
- Санітарно-гігієнічні правила при розведенні спермии, техніка виготовлення розріджувачів.
- Біоконтроль і фарбування.
Література 1. Л.7, с 120 – 127
1. Значення розведення сперми
Понад 70 років тому проф. І. І. Іванов встановив, що спермії здатні жити не тільки у природному середовищі—секретах придаткових статевих залоз, а й у штучно виготовлених середовищах — розріджувачах. Багаторічна практика штучного осіменіння показала, що в добре підібраних розріджувачах спермії живуть довше, ніж у природному середовищі. Це пояснюється кількома причинами.
По-перше, плазма сперми, яка складається з секретів придатків сім'яників та придаткових статевих залоз, не є ідеальним середовищем для тривалого зберігання сперміїв поза організмом. Слабколужні секрети передміхурової та міхурцевидних залоз активізують рух сперміїв, які перебували у придатках сім'яників у анабіотичному стані. Це необхідно, щоб забезпечити просування сперміїв у статевих шляхах самки і нормальне запліднення яйцеклітин. Проте активізація сперміїв супроводиться руйнуванням їх ліпопротеїдного покриву під дією хлористих солей натрію і калію, які містяться у плазмі сперми. Іони натрію та інших металів нейтралізують електричний заряд сперміїв, що призводить до аглютинації їх.
По-друге, у густій спермі барана і бугая при її зберіганні нагромаджується молочна кислота, яка шкідливо діє на спермії, а у великих концентраціях вбиває їх. Хоча плазма сперми має буферні властивості, ці властивості слабкі і не можуть запобігти швидкому зрушенню рН у кислий бік. І, нарешті, у спермі, яка зберігається, розвиваються мікроорганізми, які виділяють шкідливі продукти обміну речовин. Як розріджувачі для сперми пробували застосовувати найрізноманітніші рідини: сироватку крові, молоко і навіть морську воду. Проте ці спроби часто давали незадовільні результати, оскільки природні розріджувачі непостійні щодо складу, потребують старанної обробки і швидко псуються. Задовільні результати дало лише застосування молока. Значного поширення набули штучно виготовлені розчини (синтетичні середовища), спеціально призначені для розведення сперми того чи іншого виду тварин.
При розведенні сперми досягають такої мети:
1. Збільшення об'єму еякуляту, що дає можливість замінити розріджувачем значну частину сперми, яку вводять самці. Для тварин маткового типу природного осіменіння (коні, свині) збільшення об'єму сперми, що вводиться, підвищує запліднюваність самок. При осіменінні самок піхвового типу (корови, -вівці, кози) збільшення об'єму має суто технічне значення, даючи можливість поділяти еякулят на велику кількість доз і обійтися при цьому без введення доз дуже малого об'єму, що створило б значні технічні незручності.Так, виділюваний бугаєм за одну садку об'єм сперми, що дорівнює звичайно 4—6 мл, без розведення можна поділити не більш ніж на 10—20 доз (вводити коровам дози, менші за 0,3—0,5 мл, технічно важко). Розвівши той самий еякулят у 10—15 разів (звичайно, за умови, що сперма доброякісна), матимемо 40—90 мл розведеної сперми, яку можна використати для осіменіння 40—90 корів, вводячи їм по 1 мл, а при великому розведенні кількість осіменених корів може бути збільшена до 200—300.
2. Створення оптимальних умов для сперміїв частковою заміною плазми сперми розріджувачем, який містить глюкозу (або інші цукри) і цитрат натрію. Цукри є енергетичним матеріалом для сперміїв, а також охороняють їх від втрати електричного заряду. Цитрат натрію нейтралізує молочну кислоту та інші кислі продукти розпаду, зв'язує іони кальцію, які шкідливо діють на сперміїв. Крім того, цитрат натрію бере участь у процесі дихання сперміїв.
3. Підвищення стійкості сперміїв до швидкого охолодження і заморожування, що досягається введенням у розріджувач жовтка курячого яйця, гліцерину та інших речовин.
4. Гальмування обмінних процесів у сперміях, щоб подовжити строки зберігання їх. Цього досягають введенням у розріджувач таких речовин, як двоокис вуглецю, органічні кислоти, хелатон.
5. Пригнічення розвитку бактеріальної флори у спермі, для чого у розріджувач вводять антибіотики.
У деяких випадках потрібно змінити консистенцію сперми, зробивши її драглистою. У таких випадках до розріджувача додають желатину або якусь іншу речовину, що має подібні властивості.
Загальні вимоги до розріджувачів. Доброякісний розріджувач повинен забезпечити тривалу переживаність сперміїв і збереження ними запліднювальної здатності. Щоб відповідати цій основній умові, розріджувачі повинні задовольняти кілька загальних вимог.
По-перше, розріджувач повинен бути ізотонічним, тобто мати такий самий осмотичний тиск, як і у спермі того виду тварини, для якого він призначений. Концентрацію цукрів, солей та інших розчинених у розріджувачі речовин добирають за допомогою розрахунків, а потім уточнюють спеціальними дослідами на спермі відповідного виду тварин.
Виготовляючи розріджувач, треба точно відважувати згадані в інструкції кількості речовин і не менш точно відмірювати дистильовану воду, в якій розчиняються ці речовини; інакше розріджувач не буде ізотонічним. Слід звернути особливу увагу на те, щоб реактиви, які використовуються при виготовленні розріджувача, були високоякісні і зберігалися в сухому місці в добре закритих банках. Реактиви, які відволожилися, застосовувати не можна, бо кількості увібраної ними води точно врахувати неможливо. Крім того, у вологих цукрах звичайно швидко розвивається мікрофлора, яка розкладає цукри, причому утворюються шкідливі для сперміїв продукти розпаду.
Деякі солі, що застосовуються для розріджувачів (наприклад, натрієві солі лимонної і фосфорної кислот), можуть мати різну кількість так званої кристалізаційної води, яка при неправильному зберіганні (у погано закритій банці, що перебуває в дуже сухому місці) може частково втрачатися. Наявність у банці зруйнованих, побілілих кристалів, які втратили прозорість, свідчить про часткову втрату кристалізаційної води. При застосуванні такої солі розріджувач не буде ізотонічним. Слід звертати особливу увагу на склад цитрату натрію, який часто застосовується при виготовленні розріджувачів. Для розріджувачів можна використовувати тільки тризаміщений цитрат натрію, що має солонувато-лужний смак. Двозаміщений цитрат натрію (з їдким кислим смаком) застосовувати не можна. Оскільки у водопровідній і колодязній воді є розчинені речовини, склад і концентрація яких невідома, для виготовлення розріджувачів слід користуватися тільки дистильованою водою (а ще краще — бідистильованою).
Друга важлива вимога до розріджувачів полягає в тому, щоб речовини, які входять до складу їх, не діяли шкідливо на сперміїв. Не кажучи вже про "отруйні для сперміїв речовини (якими є, наприклад, солі важких металів — свинцю, олова та ін.), до розріджувача не рекомендується вводити хлористі солі, оскільки іон хлору руйнує ліпопротеїдний покрив спермія. Шкідлива дія властива також солям дво- і тривалентних металів, іони яких швидко нейтралізують електричний заряд сперміїв, внаслідок чого відбувається аглютинація останніх. Антибіотики, що вводяться у сперму, як правило, позитивно впливають на переживаність сперміїв. Проте деякі серії пеніциліну і стрептоміцину знижують життєздатність сперміїв; тому слід спеціально перевірити, чи мають вони токсичні властивості.
Склад розріджувача повинен відповідати характерним особливостям сперми даного виду тварин. Так, для густої сперми барана і бугая, в якій швидко нагромаджується молочна кислота, розріджувач повинен містити буферні солі (цитрати, фосфати), що нейтралізують кислоту; для сперми жеребця вводити буферні сполуки немає потреби. Розріджувачі для сперми жеребця, як правило, не мають солей (оскільки їх без того багато у плазмі сперми) або містяться вони у незначній кількості. Навпаки, вміст у розріджувачі цукрів значно поліпшує переживаність сперміїв.
Цукри (глюкоза, сахароза, лактоза й особливо фруктоза), а також лецитин, що вводиться з жовтком, є для сперміїв енергетичним матеріалом, а тому вони входять до складу більшості розріджувачів. Рекомендується використовувати жовтки з яскраво-оранжевим забарвленням — це сприяє кращому зберіганню сперміїв.
2.Санітарно-гігієнічні правила при розведенні сперми
Скляна посудина, в якій виготовляють розріджувач і проводять розведення, скляні палички для перемішування сперми з розріджувачем і термометри для вимірювання температури розріджувача повинні бути абсолютно чистими і заздалегідь простерилізованими. Посудини з спермою і розріджувачем закривають кришками або марлевими серветками.
Розріджувач слід виготовляти безпосередньо перед взяттям і розведенням сперми (не раніше ніж за 2— 3 год). Якщо цей строк минув, треба виготовити свіжу порцію розріджувача, а залишки першої порції вилити, бо його властивості можуть змінюватися, зокрема при кімнатній температурі в ньому звичайно розвивається мікрофлора. Температура розріджувача в момент розведення повинна дорівнювати температурі самої сперми. Холодний (порівняно зі спермою) розріджувач викликає холодовий удар сперміїв; при температурі розріджувача понад 40° може статися перегрів або навіть загибель сперміїв. При розведенні слід приливати розріджувач до сперми, а «е навпаки. Якщо лити сперму в розріджувач, то перші порції сперміїв потрапляють в умови дуже великого розведення. Оскільки розріджувач, навіть найкращий, не призначений для таких великих ступенів розведення, спермії можуть загинути.
Техніка виготовлення розріджувачів. На станціях штучного осіменіння слід відважувати сухі реактиви для виготовлення розріджувачів заздалегідь; якщо сперму від плідників беруть вранці, то наважки виготовляють напередодні увечері.
Глюкозу, цитрат натрію та інші порошкоподібні реактиви відважують на аналітичній або аптечній (роговій) вазі. Реактиви насипають роговою ложечкою; після взяття кожного з реактивів старанно обтирають її ватою, щоб виключити потрапляння одного реактиву в банку з іншим.
Добирають флакони з антибіотиками, що містять потрібну кількість одиниць дії (ОД), і висипають весь вміст флаконів у колбу або банку з наважками інших реактивів. Так, на 1 л глюкозо-цитратно-жовткового розріджувача треба вносити 750—1000 тис. ОД пеніциліну. Отже, потрібно взяти вміст десяти флаконів пеніциліну, на етикетці яких зазначено: «100 тис. ОД», або три флакони по 300 тис. ОД, або два флакони по 500 тис. ОД.
Якщо потрібно виготовити меншу кількість розріджувача, то слід визначити зважуванням, скільки важить порошок антибіотика у флаконі, і потім обчислити, в якій наважці міститиметься необхідна кількість одиниць дії. Якщо до розріджувача вводять стрептоцид, який погано розчиняється у воді кімнатної температури, то його слід відважувати в окрему чисту банку, в яку вливають, при остаточному виготовленні розріджувача повний об'єм дистильованої води, що належить за рецептом, і нагрівають банку на водяній бані при температурі 90°, помішуючи скляною паличкою до повного розчинення стрептоциду. Потім охолоджують розчин до З0—35° і виливають його в банку, де містяться наважки з іншими реактивами й антибіотиками. Нагрівати повністю виготовлений розріджувач до температури понад 40° ні в якому разі не можна, оскільки це призводить до інактивації пеніциліну та стрептоміцину і до коагуляції жовтка.Тепер промисловість випускає препарат спермосан, який містить усі бактеріостатичні речовини у потрібному співвідношенні. Після повного розчинення всіх реактивів (щоб це прискорити, розріджувач помішують стерильною паличкою) додають потрібну кількість жовтка і знову перемішують розріджувач.
Свіжі курячі яйця (від здорових курей), що застосовуються для взяття жовтка, слід обтерти тампоном, змоченим 96°-ним Спиртом-ректифікатом. Потім розбивають навпіл шкаралупу простерилізованим скальпелем, старанно зливши білок в окрему банку, перекладають жовток на фільтрувальний папір, щоб осушити його від залишків білка, проколюють оболонку жовтка стерильним скальпелем і зливають рідкий жовток (без оболонки) у стерильну мензурку. При виготовленні великої кількості розріджувача беруть відповідну кількість яєць (жовток середньої величини має в об'ємі 12—15 мл).
Банку або колбу з виготовленим розріджувачем закривають кришкою або пробкою і ставлять у посудину з теплою водою (30—35° для сперми бугая, жеребця і кнура і 25—30° для сперми барана).
3. Біоконтроль і фарбування
Біоконтроль розріджувачів. Перед тим як застосовувати для виробничих цілей розріджувач, який раніше не використовувався на станції або пункті, необхідно перевірити його якість біологічним способом на переживаність у ньому сперміїв. Таку перевірку слід практикувати і на початку використання кожної нової банки з глюкозою або іншими реактивом, що входить до складу розріджувача, нової партії антибіотиків, а також після ремонту перегінних кубів для добування дистильованої води. Біоконтроль виконують так. В 11 чисто вимитих, висушених і простерилізованих у сушильній шафі пробірок наливають по 0,5 мл розріджувача. У першу пробірку вносять за допомогою градуйованої пінетки 0,5 мл доброякісної сперми відповідного виду тварин, старанно перемішують з розріджувачем і такий самий об'єм суміші переносять у другу пробірку, знову перемішують і т. ін.
Виходить послідовний ряд розріджень сперми у 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 і 1024 рази. Пробірки щільно закривають гумовими пробками (так, щоб гума не стикалася зі спермою) і зберігають при температурах від 0 до 5° (сперму кнура при 10°). Один раз на добу беруть з кожної пробірки краплю (попередньо перемішавши вміст пробірки) і визначають під мікроскопом у термостаті з температурою 39—40° активність сперміїв.
Після загибелі (або зниження активності до 1 балу) сперміїв в усіх пробірках обчислюють абсолютні показники переживаності (див. розділ 6) для кожного розведення. Таким способом визначають оптимальне розведення і тривалість зберігання сперміями так званої виробничої (тобто допустимої при осіменінні самок) активності.
Фарбування сперми. При перевезенні флакони зі спермою окремих плідників можуть бути випадково переплутані внаслідок втрати етикеток або стирання написів. Щоб запобігти таким випадкам, Стрєлков і Родін рекомендують додавати до сперми харчові синтетичні барвники: індиго (синя), амарант (червона), тартразин і нафтоль-гельб (обидві жовті).
Розчиняють 0,1 г фарби у 3% розчині тризаміщеного цитрату натрію; 0,1 — 0,3 мл цього розчину додають до 100 мл розріджувача. Кожен колір означає певну породу або лінію плідників, про що станція заздалегідь повідомляє працівників пунктів штучного осіменіння
Ступінь розведення сперми. Ступінь розведення сперми визначається видом плідника і якістю сперми, а також потребою у розведеній спермі на пунктах штучного осіменіння. Чим вища концентрація й активність сперміїв, тим більшу ступінь розведення можна застосувати.Сперму баранів розводять у 2—4 рази (відношення об'єму сперми до об'єму розріджувача від 1 : 1 до 1 : 3). Спроби застосувати більші ступені розведення досі були невдалими: незважаючи на добру активність і переживаність сперміїв, запліднюваність овець різко спадала. Причини цього поки що не з'ясовані. Висловлювалися припущення, що зниження запліднюваності може бути внаслідок витікання розведеної сперми, в якої низька в'язкість, з шийки матки в піхву.У дозі, потрібній для осіменіння однієї вівці (0,1—0,15 мл), повинно міститися 75—100 млн. активних сперміїв.
Сперму бугаїв розводять у 10-40 разів (від 1:9 до 1:39), а в деяких випадках застосовують і більші ступені розведення. При розрахунках виходять з нормативу: ,в 1 мл розведеної сперми повинно міститися 25—50 млн. сперміїв, які рухаються прямолінійно.
Сперму кнурів розводять в 2—6 разів (від 1:1 до 1:5), а сперму жеребців — в 2—4 рази (від 1:1 до 1:3). При штучному осіменінні свиней застосовують два види розріджувачів: а) розріджувачі, призначені для розведення і зберігання сперми поза організмом, і б) розріджувачі-заповнювачі, застосовувані при фракційному способі осіменіння свиней. В останньому разі у статеві органи свині спочатку вводять розведену сперму, а слідом за нею — заповнювач, який проштовхує сперму у глибину рогів матки.