План

1.      Глибоке охолодження сперми.

2.      Техніка довгочасного зберігання сперми бугая в рідкому азоті

3.      Заморожування сперми бугая у формі гранул.

Література

1. Л. 7, с 145 – 160
2. Л. 1, с. 88 – 96 
3. Л. 4, с 84 - 93

1. Глибоке охолодження сперми

Строки зберігання сперми при температурах від ну­льової до кімнатної дуже обмежені. Проте їхня запліднювальна здатність уже через 3, рідше через 4— 5 діб різко спадає. При плюсових температурах обмінні процеси в спермі хоча й сповільнюються, але не припи­няються. Продовжується нагромадження шкідливих про­дуктів розпаду і починається процес руйнування спер­міїв, в першу чергу руйнування передньої частини голов­ки сперміїв — акросоми, яка відіграє важливу роль при заплідненні яйцеклітини.

Теоретичні міркування доказують, що подовжити строки зберігання сперми можна способом дальшого зни­ження температури, зберігання. Проте вже при темпера­турі — 0,6° сперма починає замерзати і спермії гинуть.

Основна причина загибелі клітин — кристалічне замер­зання води. Лід спочатку утворюється в рідкій, фазі сперми — плазмі. Внаслідок вимерзання води в плазмі утворюються концентровані розчини цукрів і солей, які згубно діють на сперміїв. При дальшому зниженні тем­ператури кристали льоду утворюються і в протоплазмі сперміїв, викликаючи пошкодження її тонкої структури. На початкових стадіях охолодження причиною загибелі сперміїв може бути і холодовий удар.

Щоб уникнути таких явищ, застосовують спеціальні способи обробки і охолодження сперми. Перед заморо­жуванням її розводять середовищами, які містять жов­ток курячого яйця і гліцерин, а також деякі цукри (найчастіше лактозу). Жовток, крім того що він значно зменшує небезпеку холодового удару, є, очевидно, своє­рідним «осмотичним буфером» і захищає сперміїв від шкідливої дії концентрованих розчинів, які утворюються в плазмі сперми при її замерзанні.

При введенні гліцерину знижується точка замерзан­ня сперми, і вона стає здатною до досить глибокого пе­реохолодження. Це стосується не тільки рідкої фази (плазми) сперми, а й протоплазми сперміїв, оскільки гліцерин швидко проникає крізь оболонку клітин.

При певних умовах дія гліцерину на спермії може бути несприятливою. Якщо швидко розвести сперму со­льовим розчином з добавкою гліцерину (понад 5%), то спермії гинуть або пошкоджуються: відбувається пере­гин спермія в точці з'єднання тіла з хвостом, спермій ніби складається удвоє, але продовжує рухатися з віді­гнутою назад головкою. Така характерна деформація спостерігається тільки у сперміїв, які рухаються. Тому сперму розводять гліцеринізованими середовищами після попереднього охолодження і витримки при температурі 2—5° протягом 3—6 год. При зниженій температурі рух сперміїв припиняється і шкідлива дія гліцерину значно зменшується.

Можна також додавати гліцеринізоване середовище поступово, невеликими порціями. У всих випадках середовище і сперма повинні мати однакову температуру.

Дуже велике значення має режим охолодження спер­ми при її заморожуванні. Тепер застосовують два режи­ми заморожування: 1) швидке заморожування малих об'ємів сперми у вигляді гранул або в поліетиленових чи полістиролових трубочках - капілярах та 2) більш по­вільне заморожування в поліетиленових чи скляних ампулах.

Теоретичною основою методу швидкого заморожуван­ня сперми є гіпотеза про можливості склоподібного некристалічного затвердіння (вітрифікації) біологічних об'єктів, у тому числі і сперми.

Щоб зрозуміти, як можна досягти вітрифікації клі­тин, треба пригадати, як відбувається процес кристалі­зації води три замерзанні. В охолоджуваній воді утво­рюються зародкові центри кристалізації — скупчення молекул з малою кінетичною енергією (або які-небудь сторонні включення, наприклад дрібні пухирці повітря). В'язкість води, яка зростає із зниженням температури, а також уповільнення теплового руху молекул спочатку полегшують утворення таких центрів і зростання утво­рених кристалів, але потім починають перешкоджати пе­реміщенню молекул у рідині, що необхідне для утворен­ня «кристалічної решітки». Тому при дальшому знижен­ні температури швидкість кристалізаційних процесів зменшується і, нарешті, падає майже до нуля.

Нижня межа температурного інтервалу, у якому інтенсивно відбувається кристалізація, досі точно не ви­значена. При заморожуванні сперми вона лежить, мабуть, між —40° і —50°.

Якщо сперму охолоджувати повільно, то вся вода, яка міститься в ній, встигне закристалізуватися, і спермії загинуть. Але при швидкому охолодженні вдається «проскочити» небезпечну температурну зону кристалізації і досягти зони вітрифікації, де протоплазма сперміїв за­стигає як єдине ціле, без вимерзання води, і без утворення льоду; при цьому зберігається тонка структура протоплазми і ядра.

Високі швидкості охолодження досягаються лише при певних умовах.

По-перше, треба охолоджувати дуже ма­ленькі об'єми сперми (0,1—0,5 мл); при заморожуванні великих об'ємів охолодження уповільнюється і в спермі вся вода перетворюється на кристалічний лід.

По-друге, необхідні охолоджувачі з досить низькою температурою. Звичайно використовують рідкий азот, який має температуру кипіння — 196°. Рідкий кисень (температура кипіння — 183°) вогненебезпечний і тому для зберігання сперми не застосовується. Твердий дво­окис вуглецю (сухий лід) останнім часом перестали за­стосовувати через відносно високу температуру його ви­паровування (—78°); ця температура лежить недалеко від нижньої межі зони кристалічного замерзання.

Склоподібний стан нестійкий. За певних умов, зокре­ма внаслідок підвищення температури, у вітрифікованій спермі може початися утворення кристалів (девітрифікація). Щоб запобігти цьому, сперму треба зберігати при достатньо низьких температурах (нижче —100°), не допускаючи навіть короткочасного нагріву. Розморожу­вати сперму треба з максимальною швидкістю. У цьому випадку при проходженні через небезпечну температурну зону кристали льоду не встигнуть утворитись, і сперма безпосередньо із склоподібного стану перейде в рідкий.

Слід зазначити, що деякі вчені мають сумнів щодо можливості вітрифікації сперми і вважають, що внаслідок швидкого охолодження відбувається не вітрифікація, а дрібнокристалічне замерзання води, менш шкідливе для сперміїв, ніж утворення великих кристалів льоду при по­вільному заморожуванні. Це питання остаточно не вирі­шено, але, в усякому разі, всі визнають доцільність швидкого заморожування та розморожування сперми.

Ще у 1949 р. І.В.Смирнов вперше висловив гіпотезу про можливість одночасного (або, вірніше, майже одно­часного) перебігу процесів кристалізації та вітрифікації при заморожуванні сперми. У цьому розумінні процес кристалізації у плазмі сперми розглядається як пози­тивне явище, яке сприяє вітрифікації самих сперміїв.

Згідно з цією гіпотезою, при не занадто швидкому (але й не занадто повільному) охолоджуванні сперми починається кристалізація так званої вільної води у рідкій фазі (плазмі) сперми. Поміж кристалами льоду утворюється концентрований розчин цукрів і солей, під дією якого з клітин витягується вільна вода, слабо зв'язана з білками та іншими колоїдами протоплазми. Спермії при цьому не гинуть, оскільки за низьких температур вони менш чутливі до гіпертонічних розчинів, ніж за плюсових. Втрата вільної води зменшує можливість утво­рення кристалів усередині клітин і сприяє вітрифікації протоплазми.

2. Техніка довгочасного зберігання сперми бугая в рідкому азоті

З наведеного випливає, що сперму, яка зберігається в рідкому азоті, слід оберігати від підвищення темпера­тури. Для цього необхідно своєчасно доливати рідкий азот у посудини, де зберігається сперма, і якнайрідше витягати з них мішечки або каністри зі спермою: при кожному такому взятті температура сперми може підвищитись.

Усі існуючі методи глибокого заморожування сперми передбачають попереднє повільне охолодження (протя­гом 3—4 год) від кімнатної температури до 2—4° та ви­тримування при цій температурі протягом деякого часу (так звана адаптація сперміїв). Значення адапта­ції полягає в тому, що спермії при температурі близь­ко 0° переходять у стан неповного анабіозу і легше пере­носять осмотичні зміни в процесі заморожування, ніж у тому випадку, коли обмінні процеси відбуваються на високому рівні. Крім того, внаслідок охолодження спер­ми, від нульової температури„скорочується час перебу­вання сперми у рідкому стані, а отже, зменшується не­безпека холодового удару, який спостерігається тільки в рідкій спермі.

До останнього часу в літературі часто застосовували термін «еквілібрація», розуміючи повільне проникнення гліцерину всередину сперміїв. Оскільки тепер установле­но, що гліцерин проникає у клітини досить швидко, від цього терміну, мабуть, треба відмовитись.

Незважаючи на те, що для зберігання сперми у рідкому азоті потрібне складне і дороге обладнання, цей метод з кожним роком дедалі ширше застосовується. Це пояснюється великими перевагами заморожування сперми порівняно з іншими способами її зберігання. При температурі рід­кого азоту обмінні процеси в спермі уповільнюються у мільйони разів (а, можливо, і зовсім припиняються), завдяки чому не відбуваються ті необоротні зміни, які у звичайних умовах призводять до загибелі сперміїв. Перебуваючи у стані глибокого анабіозу, спермії можуть зберігати свої біологічні властивості, у тому числі здат­ність запліднювати яйцеклітини і передавати генетичну інформацію протягом багатьох років і навіть десятиріч (звичайно, в разі суворого додержання правил зберігання). У зв'язку з цим уже тепер організовуються спеціальні спермосховища (спермотеки) для зберігання зразків сперми від найвидатніших плідників. Ці зразки можуть бути використані через багато років після смерті плідників, що великою мірою розширить можливості племінної роботи.

І, нарешті, тривале зберігання сперми в рідкому азоті відкриває широкі перспективи для впровадження на всіх фермах (у тому числі і на неплемінних) найдосконалі­ших методів племінної роботи, зокрема індивідуального добору батьківських пар.

Тепер досить досконало розроблено техніку заморо­жування сперми бугаїв і ведуться успішні досліди із за­морожування сперми жеребців, баранів і кнурів.

В розробці методів тривалого зберігання сперми важ­ливу роль відіграли досліди радянських учених. Потомство від самок (кролиць, овець та корів), осіменених спермою, яка зберігалася в умовах глибокого охоло­дження протягом тривалого часу, було вперше у світі одержано в СРСР (І.В. Смирнов, 1948—1951).

3. Метод швидкого заморожування сперми бугая у формі гранул

Існує в двох варіантах: 1) заморожування на полі­мерних пластинах у парі рідкого азоту і 2) заморожуван­ня на блоках сухого льоду (твердого двоокису вуглецю). Перед взяттям сперми від бугая треба підготувати холодильник або термос з льодом для її попереднього охолодження та посудини з рідким азотом, простерилізу­вати посуд і обладнання, а також приміщення, де прова­дитиметься заморожування (бактерицидними лампами). Потім готують спеціальний розріджувач з гліцерином і жовтком курячого яйця. Найчастіше застосовують сере­довища такого складу:

Середовище № 1: Вода дистильована                 100 мл

                                Лактоза                                 11,5 г

                                Жовток                                    20 мл   

                                Гліцерин                                    5 мл

                                Пеніцилін                               75—100 тис. ОД

                                Стрептоміцин                         75—100 тис. ОД

Середовище № 2: 11% розчин лактози                          63 мл

                                Жовток                                             30 мл

                                Гліцерин                                             7 мл

Для приготування 11% розчину лактози розчиняють 11 г останньої в 100 мл дистильованої води. До 100 мл готового середовища (з жовтком і гліцерином) додають 0,1 г стрептоміцину.

Середовище № 1 звичайно застосовують при заморо­жуванні сперми на фторопластовій пластині, середови­ще № 2 — при заморожуванні на блоці сухого льоду.

Оцінивши взяту від плідника сперму за густотою, активністю і концентрацією сперміїв, її розводять у від­ношенні від 1 : 1 до 1 : 3 (в залежності від якості). В одній гранулі розведеної сперми (0,1—0,2 мл) після її заморожування та відтавання повинно бути не менш як 20—25 мл активних сперміїв.

Заздалегідь відміряну дозу середовища, яке містить гліцерин, підливають до сперми поступово, невеликими порціями по стінці флакона і обережно похитуючи фла­кон для перемішування сперми з розріджувачем. Посту­пове розведення триває 2—5 хв. При швидкому розве­денні гліцерин викликає деформацію сперміїв, про яку йшлося вище.

Закриті пробками флакони з розведеною спермою кладуть на полицю електричного холодильника або в харчовий термос, наполовину заповнений льодом, і охолоджують до температури 2—4° із швидкістю до 1 градуса за хвилину. Для цього флакони ставлять не прямо на лід, а кладуть поверх нього шар вати 1—2 см завтовшки, а при охолодженні в холодильнику ставлять флакони в плоску кювету з водою, яка має темпера­туру 30°.

Сперму витримують при температурі 2—4° протягом 4—б год, після чого заморожують в охолодженому стані не допускаючи нагріву.

Заморожування, сперми на фтороплас­товій пластині. Пластина під час заморожування повинна мати температуру — 80—90% Для охолодження її витримують у парі рідкого азоту протягом 10 хв. Якщо є широкогорла посудина Дьюара (наприклад, «Харьков-37»), то пластину підвішують всередині її на відста­ні 6 см від поверхні рідкого азоту. Якщо такої посудини немає, наливають рідкий азот у ванну (металеву емальо­вану кювету) з теплоізоляцією з пінопласту не менш як 10 см завтовшки. Фторопластову пластину за­нурюють у рідкий азот на 1 хв, а потім витягають і помі­щають на відстані 2—3 см від поверхні азоту.

Пластмасовий шприц з приєднаною до нього голкою для взяття крові (або поліетиленову крапельницю) за­здалегідь стерилізують і охолоджують у холодильнику до температури 2—4°. Після охолодження фторопластової пластини у парі рідкого азоту набирають у холодний шприц (намагаючись не нагрівати його) охолоджену сперму і швидко накрапують у маленькі лунки, що є на поверхні пластини, по 2—4 краплі у кожну лунку. Спер­ма швидко замерзає у формі маленьких кульок (гра­нул). Об'єм кожної гранули дорівнює 0,1—0,2 мл. Гра­нули витримують на пластині протягом 5—6 хв, зану­рюють пластину з гранулами на 5—10 сек. у рідкий азот, витягують з нього і зчищають гранули охолодженою у рідкому азоті лопаточкою з органічного скла в кювету або кухоль з рідким азотом.

Заморозивши еякулят одного бугая, зсипають грану­ли з кювети чи кухля в пластмасові чашечки або у мар­леві мішечки, які заздалегідь охолоджують у рідкому азоті. Прикріпивши бірки з кличкою бугая і датою замо­рожування сперми, чашечки та мішечки опускають у ста­ціонарне сховище або в посудину Дьюара («Харків-30» чи іншого типу), заповнену рідким азотом.

На всіх етапах заморожування не можна допускати хоча б короткочасного нагріву гранул, чашечок або мі­шечків.

Для перевірки активності сперміїв після заморожу­вання і перед використанням сперми для осіменіння корів сперму відтаюють у теплому 2,9—3% розчині цит­рату натрію. Один мілілітр розчину відмірюють стериль­ною піпеткою в стерильний пеніциліновий флакон, закри­вають пробкою і ставлять у термостат або на водяну ба­ню (стежачи, щоб вода не потрапила всередину флакона) при температурі 40°. Охолодженим до температури рід­кого азоту довгим анатомічним пінцетом витягують з ча­шечки або мішечка гранулу сперми і якнайшвидше опус­кають у нагрітий розчин. Пінцет слід тримати рукою у шкіряній рукавичці, щоб уникнути опіків. Для приско­рення відтавання гранул злегка похитують флакон. Від­разу ж після розтавання гранул флакон витягують з теп­лої води.

Досліди І.В. Смирнова та О.Е. Бруєнко показали, що при підвищенні температури розчину до 60° і навіть 80°  активність сперміїв після розморожування, значно підвищується. Але при таких температурах необхідно вживати заходи проти перегріву сперміїв.

3% розчин цитрату натрію готують на станціях штуч­ного осіменіння в стерильних умовах, розфасовують по флаконах чи ампулах і відсилають на пункти.

Активність сперміїв після розморожування визнача­ють у термостаті при температурі 38—40⁰. Для осіменін­ня корів і телиць допускається сперма з активністю не нижчою як 4 бали. Численні досліди та практика роботи станцій показали, що така активність забезпечує досить високу запліднюваність корів. Цілком ймовірно, що в процесі заморожування і відтаювання гинуть найслабкіші спермії і залишаються живими найбільш життє­здатні.

Щоб не допустити плутанини, кожна чашечка чи мі­шечок повинні мати бірку з написом, який не змивається. Стаціонарне сховище повинно мати план розміщення сперм різних плідників, щоб можна було швидко знайти потрібну посудину.

Заморожування сперми на блоках су­хого льоду провадиться майже за такими ж прави­лами, що й заморожування на фторопластових пласти­нах. Різниця полягає в тому, що сперму накрапують у лунки, видавлені на поверхні сухого льоду за допомо­гою гарячої праски з виступами. Застосування сухого льоду обходиться досить дорого. Але воно має ту пере­вагу, що гранули не прилипають до сухого льоду, як це відбувається на фторопластових пластинах внаслідок електризації їх.

При заморожуванні сперми не слід дихати на фторопластову пластину чи поверхню сухого льоду, оскільки водяна пара осідає у вигляді снігу, що утруднює заморо­жування і погіршує його результати. Треба працювати у марлевій масці. Наліт снігу час від часу зчищають або здувають за допомогою гумового балону.

Заморожування сперми у вигляді об­лицьованих гранул. Сперму після взяття та оцін­ки розводять середовищем, до складу якого входять: во­да дистильована—100 мл, лактоза — 6 г, глікокол — 0,2 г, цитрат натрію тризаміщений 5-водний— 1,7 г, жовток — 20 мл, гліцерин — 5 мл, тетрациклін солянокис­лий — 5 тис. ОД. В одній дозі (0,2 мл) розведеної сперми повинно міститися не менш як 50 млн. активних сперміїв.

Витримавши сперму при температурі 2—4° протягом 4—б год, нею заповнюють тонкостінну поліетиленову трубку, яку потім пропускають через спеціальний апа­рат. Цей апарат розрізує трубку на окремі маленькі (по 0,2 мл сперми) частини і одночасно герметизує кожну облицьовану гранулу. Гранули заморожують у парі рід­кого азоту, для чого витримують їх на відстані 3—5 см від поверхні азоту протягом 3—4 хв.

Для відтаювання гранули занурюють у теплу (38— 40°) воду.