Теоретичні і практичні основи заморожування сперми
План
1. Глибоке охолодження сперми.
2. Техніка довгочасного зберігання сперми бугая в рідкому азоті
3. Заморожування сперми бугая у формі гранул.
Література
- Л. 7, с 145 – 160
- Л. 1, с. 88 – 96
- Л. 4, с 84 - 93
1. Глибоке охолодження сперми
Строки зберігання сперми при температурах від нульової до кімнатної дуже обмежені. Проте їхня запліднювальна здатність уже через 3, рідше через 4— 5 діб різко спадає. При плюсових температурах обмінні процеси в спермі хоча й сповільнюються, але не припиняються. Продовжується нагромадження шкідливих продуктів розпаду і починається процес руйнування сперміїв, в першу чергу руйнування передньої частини головки сперміїв — акросоми, яка відіграє важливу роль при заплідненні яйцеклітини.
Теоретичні міркування доказують, що подовжити строки зберігання сперми можна способом дальшого зниження температури, зберігання. Проте вже при температурі — 0,6° сперма починає замерзати і спермії гинуть.
Основна причина загибелі клітин — кристалічне замерзання води. Лід спочатку утворюється в рідкій, фазі сперми — плазмі. Внаслідок вимерзання води в плазмі утворюються концентровані розчини цукрів і солей, які згубно діють на сперміїв. При дальшому зниженні температури кристали льоду утворюються і в протоплазмі сперміїв, викликаючи пошкодження її тонкої структури. На початкових стадіях охолодження причиною загибелі сперміїв може бути і холодовий удар.
Щоб уникнути таких явищ, застосовують спеціальні способи обробки і охолодження сперми. Перед заморожуванням її розводять середовищами, які містять жовток курячого яйця і гліцерин, а також деякі цукри (найчастіше лактозу). Жовток, крім того що він значно зменшує небезпеку холодового удару, є, очевидно, своєрідним «осмотичним буфером» і захищає сперміїв від шкідливої дії концентрованих розчинів, які утворюються в плазмі сперми при її замерзанні.
При введенні гліцерину знижується точка замерзання сперми, і вона стає здатною до досить глибокого переохолодження. Це стосується не тільки рідкої фази (плазми) сперми, а й протоплазми сперміїв, оскільки гліцерин швидко проникає крізь оболонку клітин.
При певних умовах дія гліцерину на спермії може бути несприятливою. Якщо швидко розвести сперму сольовим розчином з добавкою гліцерину (понад 5%), то спермії гинуть або пошкоджуються: відбувається перегин спермія в точці з'єднання тіла з хвостом, спермій ніби складається удвоє, але продовжує рухатися з відігнутою назад головкою. Така характерна деформація спостерігається тільки у сперміїв, які рухаються. Тому сперму розводять гліцеринізованими середовищами після попереднього охолодження і витримки при температурі 2—5° протягом 3—6 год. При зниженій температурі рух сперміїв припиняється і шкідлива дія гліцерину значно зменшується.
Можна також додавати гліцеринізоване середовище поступово, невеликими порціями. У всих випадках середовище і сперма повинні мати однакову температуру.
Дуже велике значення має режим охолодження сперми при її заморожуванні. Тепер застосовують два режими заморожування: 1) швидке заморожування малих об'ємів сперми у вигляді гранул або в поліетиленових чи полістиролових трубочках - капілярах та 2) більш повільне заморожування в поліетиленових чи скляних ампулах.
Теоретичною основою методу швидкого заморожування сперми є гіпотеза про можливості склоподібного некристалічного затвердіння (вітрифікації) біологічних об'єктів, у тому числі і сперми.
Щоб зрозуміти, як можна досягти вітрифікації клітин, треба пригадати, як відбувається процес кристалізації води три замерзанні. В охолоджуваній воді утворюються зародкові центри кристалізації — скупчення молекул з малою кінетичною енергією (або які-небудь сторонні включення, наприклад дрібні пухирці повітря). В'язкість води, яка зростає із зниженням температури, а також уповільнення теплового руху молекул спочатку полегшують утворення таких центрів і зростання утворених кристалів, але потім починають перешкоджати переміщенню молекул у рідині, що необхідне для утворення «кристалічної решітки». Тому при дальшому зниженні температури швидкість кристалізаційних процесів зменшується і, нарешті, падає майже до нуля.
Нижня межа температурного інтервалу, у якому інтенсивно відбувається кристалізація, досі точно не визначена. При заморожуванні сперми вона лежить, мабуть, між —40° і —50°.
Якщо сперму охолоджувати повільно, то вся вода, яка міститься в ній, встигне закристалізуватися, і спермії загинуть. Але при швидкому охолодженні вдається «проскочити» небезпечну температурну зону кристалізації і досягти зони вітрифікації, де протоплазма сперміїв застигає як єдине ціле, без вимерзання води, і без утворення льоду; при цьому зберігається тонка структура протоплазми і ядра.
Високі швидкості охолодження досягаються лише при певних умовах.
По-перше, треба охолоджувати дуже маленькі об'єми сперми (0,1—0,5 мл); при заморожуванні великих об'ємів охолодження уповільнюється і в спермі вся вода перетворюється на кристалічний лід.
По-друге, необхідні охолоджувачі з досить низькою температурою. Звичайно використовують рідкий азот, який має температуру кипіння — 196°. Рідкий кисень (температура кипіння — 183°) вогненебезпечний і тому для зберігання сперми не застосовується. Твердий двоокис вуглецю (сухий лід) останнім часом перестали застосовувати через відносно високу температуру його випаровування (—78°); ця температура лежить недалеко від нижньої межі зони кристалічного замерзання.
Склоподібний стан нестійкий. За певних умов, зокрема внаслідок підвищення температури, у вітрифікованій спермі може початися утворення кристалів (девітрифікація). Щоб запобігти цьому, сперму треба зберігати при достатньо низьких температурах (нижче —100°), не допускаючи навіть короткочасного нагріву. Розморожувати сперму треба з максимальною швидкістю. У цьому випадку при проходженні через небезпечну температурну зону кристали льоду не встигнуть утворитись, і сперма безпосередньо із склоподібного стану перейде в рідкий.
Слід зазначити, що деякі вчені мають сумнів щодо можливості вітрифікації сперми і вважають, що внаслідок швидкого охолодження відбувається не вітрифікація, а дрібнокристалічне замерзання води, менш шкідливе для сперміїв, ніж утворення великих кристалів льоду при повільному заморожуванні. Це питання остаточно не вирішено, але, в усякому разі, всі визнають доцільність швидкого заморожування та розморожування сперми.
Ще у 1949 р. І.В.Смирнов вперше висловив гіпотезу про можливість одночасного (або, вірніше, майже одночасного) перебігу процесів кристалізації та вітрифікації при заморожуванні сперми. У цьому розумінні процес кристалізації у плазмі сперми розглядається як позитивне явище, яке сприяє вітрифікації самих сперміїв.
Згідно з цією гіпотезою, при не занадто швидкому (але й не занадто повільному) охолоджуванні сперми починається кристалізація так званої вільної води у рідкій фазі (плазмі) сперми. Поміж кристалами льоду утворюється концентрований розчин цукрів і солей, під дією якого з клітин витягується вільна вода, слабо зв'язана з білками та іншими колоїдами протоплазми. Спермії при цьому не гинуть, оскільки за низьких температур вони менш чутливі до гіпертонічних розчинів, ніж за плюсових. Втрата вільної води зменшує можливість утворення кристалів усередині клітин і сприяє вітрифікації протоплазми.
2. Техніка довгочасного зберігання сперми бугая в рідкому азоті
З наведеного випливає, що сперму, яка зберігається в рідкому азоті, слід оберігати від підвищення температури. Для цього необхідно своєчасно доливати рідкий азот у посудини, де зберігається сперма, і якнайрідше витягати з них мішечки або каністри зі спермою: при кожному такому взятті температура сперми може підвищитись.
Усі існуючі методи глибокого заморожування сперми передбачають попереднє повільне охолодження (протягом 3—4 год) від кімнатної температури до 2—4° та витримування при цій температурі протягом деякого часу (так звана адаптація сперміїв). Значення адаптації полягає в тому, що спермії при температурі близько 0° переходять у стан неповного анабіозу і легше переносять осмотичні зміни в процесі заморожування, ніж у тому випадку, коли обмінні процеси відбуваються на високому рівні. Крім того, внаслідок охолодження сперми, від нульової температури„скорочується час перебування сперми у рідкому стані, а отже, зменшується небезпека холодового удару, який спостерігається тільки в рідкій спермі.
До останнього часу в літературі часто застосовували термін «еквілібрація», розуміючи повільне проникнення гліцерину всередину сперміїв. Оскільки тепер установлено, що гліцерин проникає у клітини досить швидко, від цього терміну, мабуть, треба відмовитись.
Незважаючи на те, що для зберігання сперми у рідкому азоті потрібне складне і дороге обладнання, цей метод з кожним роком дедалі ширше застосовується. Це пояснюється великими перевагами заморожування сперми порівняно з іншими способами її зберігання. При температурі рідкого азоту обмінні процеси в спермі уповільнюються у мільйони разів (а, можливо, і зовсім припиняються), завдяки чому не відбуваються ті необоротні зміни, які у звичайних умовах призводять до загибелі сперміїв. Перебуваючи у стані глибокого анабіозу, спермії можуть зберігати свої біологічні властивості, у тому числі здатність запліднювати яйцеклітини і передавати генетичну інформацію протягом багатьох років і навіть десятиріч (звичайно, в разі суворого додержання правил зберігання). У зв'язку з цим уже тепер організовуються спеціальні спермосховища (спермотеки) для зберігання зразків сперми від найвидатніших плідників. Ці зразки можуть бути використані через багато років після смерті плідників, що великою мірою розширить можливості племінної роботи.
І, нарешті, тривале зберігання сперми в рідкому азоті відкриває широкі перспективи для впровадження на всіх фермах (у тому числі і на неплемінних) найдосконаліших методів племінної роботи, зокрема індивідуального добору батьківських пар.
Тепер досить досконало розроблено техніку заморожування сперми бугаїв і ведуться успішні досліди із заморожування сперми жеребців, баранів і кнурів.
В розробці методів тривалого зберігання сперми важливу роль відіграли досліди радянських учених. Потомство від самок (кролиць, овець та корів), осіменених спермою, яка зберігалася в умовах глибокого охолодження протягом тривалого часу, було вперше у світі одержано в СРСР (І.В. Смирнов, 1948—1951).
3. Метод швидкого заморожування сперми бугая у формі гранул
Існує в двох варіантах: 1) заморожування на полімерних пластинах у парі рідкого азоту і 2) заморожування на блоках сухого льоду (твердого двоокису вуглецю). Перед взяттям сперми від бугая треба підготувати холодильник або термос з льодом для її попереднього охолодження та посудини з рідким азотом, простерилізувати посуд і обладнання, а також приміщення, де провадитиметься заморожування (бактерицидними лампами). Потім готують спеціальний розріджувач з гліцерином і жовтком курячого яйця. Найчастіше застосовують середовища такого складу:
Середовище № 1: Вода дистильована 100 мл
Лактоза 11,5 г
Жовток 20 мл
Гліцерин 5 мл
Пеніцилін 75—100 тис. ОД
Стрептоміцин 75—100 тис. ОД
Середовище № 2: 11% розчин лактози 63 мл
Жовток 30 мл
Гліцерин 7 мл
Для приготування 11% розчину лактози розчиняють 11 г останньої в 100 мл дистильованої води. До 100 мл готового середовища (з жовтком і гліцерином) додають 0,1 г стрептоміцину.
Середовище № 1 звичайно застосовують при заморожуванні сперми на фторопластовій пластині, середовище № 2 — при заморожуванні на блоці сухого льоду.
Оцінивши взяту від плідника сперму за густотою, активністю і концентрацією сперміїв, її розводять у відношенні від 1 : 1 до 1 : 3 (в залежності від якості). В одній гранулі розведеної сперми (0,1—0,2 мл) після її заморожування та відтавання повинно бути не менш як 20—25 мл активних сперміїв.
Заздалегідь відміряну дозу середовища, яке містить гліцерин, підливають до сперми поступово, невеликими порціями по стінці флакона і обережно похитуючи флакон для перемішування сперми з розріджувачем. Поступове розведення триває 2—5 хв. При швидкому розведенні гліцерин викликає деформацію сперміїв, про яку йшлося вище.
Закриті пробками флакони з розведеною спермою кладуть на полицю електричного холодильника або в харчовий термос, наполовину заповнений льодом, і охолоджують до температури 2—4° із швидкістю до 1 градуса за хвилину. Для цього флакони ставлять не прямо на лід, а кладуть поверх нього шар вати 1—2 см завтовшки, а при охолодженні в холодильнику ставлять флакони в плоску кювету з водою, яка має температуру 30°.
Сперму витримують при температурі 2—4° протягом 4—б год, після чого заморожують в охолодженому стані не допускаючи нагріву.
Заморожування, сперми на фторопластовій пластині. Пластина під час заморожування повинна мати температуру — 80—90% Для охолодження її витримують у парі рідкого азоту протягом 10 хв. Якщо є широкогорла посудина Дьюара (наприклад, «Харьков-37»), то пластину підвішують всередині її на відстані 6 см від поверхні рідкого азоту. Якщо такої посудини немає, наливають рідкий азот у ванну (металеву емальовану кювету) з теплоізоляцією з пінопласту не менш як 10 см завтовшки. Фторопластову пластину занурюють у рідкий азот на 1 хв, а потім витягають і поміщають на відстані 2—3 см від поверхні азоту.
Пластмасовий шприц з приєднаною до нього голкою для взяття крові (або поліетиленову крапельницю) заздалегідь стерилізують і охолоджують у холодильнику до температури 2—4°. Після охолодження фторопластової пластини у парі рідкого азоту набирають у холодний шприц (намагаючись не нагрівати його) охолоджену сперму і швидко накрапують у маленькі лунки, що є на поверхні пластини, по 2—4 краплі у кожну лунку. Сперма швидко замерзає у формі маленьких кульок (гранул). Об'єм кожної гранули дорівнює 0,1—0,2 мл. Гранули витримують на пластині протягом 5—6 хв, занурюють пластину з гранулами на 5—10 сек. у рідкий азот, витягують з нього і зчищають гранули охолодженою у рідкому азоті лопаточкою з органічного скла в кювету або кухоль з рідким азотом.
Заморозивши еякулят одного бугая, зсипають гранули з кювети чи кухля в пластмасові чашечки або у марлеві мішечки, які заздалегідь охолоджують у рідкому азоті. Прикріпивши бірки з кличкою бугая і датою заморожування сперми, чашечки та мішечки опускають у стаціонарне сховище або в посудину Дьюара («Харків-30» чи іншого типу), заповнену рідким азотом.
На всіх етапах заморожування не можна допускати хоча б короткочасного нагріву гранул, чашечок або мішечків.
Для перевірки активності сперміїв після заморожування і перед використанням сперми для осіменіння корів сперму відтаюють у теплому 2,9—3% розчині цитрату натрію. Один мілілітр розчину відмірюють стерильною піпеткою в стерильний пеніциліновий флакон, закривають пробкою і ставлять у термостат або на водяну баню (стежачи, щоб вода не потрапила всередину флакона) при температурі 40°. Охолодженим до температури рідкого азоту довгим анатомічним пінцетом витягують з чашечки або мішечка гранулу сперми і якнайшвидше опускають у нагрітий розчин. Пінцет слід тримати рукою у шкіряній рукавичці, щоб уникнути опіків. Для прискорення відтавання гранул злегка похитують флакон. Відразу ж після розтавання гранул флакон витягують з теплої води.
Досліди І.В. Смирнова та О.Е. Бруєнко показали, що при підвищенні температури розчину до 60° і навіть 80° активність сперміїв після розморожування, значно підвищується. Але при таких температурах необхідно вживати заходи проти перегріву сперміїв.
3% розчин цитрату натрію готують на станціях штучного осіменіння в стерильних умовах, розфасовують по флаконах чи ампулах і відсилають на пункти.
Активність сперміїв після розморожування визначають у термостаті при температурі 38—400. Для осіменіння корів і телиць допускається сперма з активністю не нижчою як 4 бали. Численні досліди та практика роботи станцій показали, що така активність забезпечує досить високу запліднюваність корів. Цілком ймовірно, що в процесі заморожування і відтаювання гинуть найслабкіші спермії і залишаються живими найбільш життєздатні.
Щоб не допустити плутанини, кожна чашечка чи мішечок повинні мати бірку з написом, який не змивається. Стаціонарне сховище повинно мати план розміщення сперм різних плідників, щоб можна було швидко знайти потрібну посудину.
Заморожування сперми на блоках сухого льоду провадиться майже за такими ж правилами, що й заморожування на фторопластових пластинах. Різниця полягає в тому, що сперму накрапують у лунки, видавлені на поверхні сухого льоду за допомогою гарячої праски з виступами. Застосування сухого льоду обходиться досить дорого. Але воно має ту перевагу, що гранули не прилипають до сухого льоду, як це відбувається на фторопластових пластинах внаслідок електризації їх.
При заморожуванні сперми не слід дихати на фторопластову пластину чи поверхню сухого льоду, оскільки водяна пара осідає у вигляді снігу, що утруднює заморожування і погіршує його результати. Треба працювати у марлевій масці. Наліт снігу час від часу зчищають або здувають за допомогою гумового балону.
Заморожування сперми у вигляді облицьованих гранул. Сперму після взяття та оцінки розводять середовищем, до складу якого входять: вода дистильована—100 мл, лактоза — 6 г, глікокол — 0,2 г, цитрат натрію тризаміщений 5-водний— 1,7 г, жовток — 20 мл, гліцерин — 5 мл, тетрациклін солянокислий — 5 тис. ОД. В одній дозі (0,2 мл) розведеної сперми повинно міститися не менш як 50 млн. активних сперміїв.
Витримавши сперму при температурі 2—4° протягом 4—б год, нею заповнюють тонкостінну поліетиленову трубку, яку потім пропускають через спеціальний апарат. Цей апарат розрізує трубку на окремі маленькі (по 0,2 мл сперми) частини і одночасно герметизує кожну облицьовану гранулу. Гранули заморожують у парі рідкого азоту, для чого витримують їх на відстані 3—5 см від поверхні азоту протягом 3—4 хв.
Для відтаювання гранули занурюють у теплу (38— 40°) воду.