Технологія розрідження, зберігання, транспортування сперми

План

  1. Значення розведення спермии, загальні вимоги до розріджувачів.
  2. Санітарно-гігієнічні правила при розведенні спермии, техніка виготовлення розріджувачів.
  3. Біоконтроль і фарбування.

Література    1.   Л.7, с 120 – 127

1. Значення розведення сперми

Понад 70 років тому проф. І. І. Іванов встановив, що спермії здатні жити не тільки у природному середо­вищі—секретах придаткових статевих залоз, а й у штучно виготовлених середовищах — розріджувачах. Багаторічна практика штучного осіменіння показала, що в добре підібраних розріджувачах спермії живуть довше, ніж у природному середовищі. Це пояснюється кількома причинами.

По-перше, плазма сперми, яка складається з секретів придатків сім'яників та придаткових статевих залоз, не є ідеальним середовищем для тривалого зберігання сперміїв поза організмом. Слабколужні секрети перед­міхурової та міхурцевидних залоз активізують рух сперміїв, які перебували у придатках сім'яників у ана­біотичному стані. Це необхідно, щоб забезпечити просу­вання сперміїв у статевих шляхах самки і нормальне запліднення яйцеклітин. Проте активізація сперміїв супроводиться руйнуванням їх ліпопротеїдного покриву під дією хлористих солей натрію і калію, які містяться у плазмі сперми. Іони натрію та інших металів нейтралі­зують електричний заряд сперміїв, що призводить до аглютинації їх.

По-друге, у густій спермі барана і бугая при її збе­ріганні нагромаджується молочна кислота, яка шкідливо діє на спермії, а у великих концентраціях вбиває їх. Хоча плазма сперми має буферні властивості, ці властивості слабкі і не можуть запобігти швидкому зрушен­ню рН у кислий бік. І, нарешті, у спермі, яка зберігається, розвиваються мікроорганізми, які виділяють шкідливі продукти обмі­ну речовин. Як розріджувачі для сперми пробували застосовува­ти найрізноманітніші рідини: сироватку крові, молоко і навіть морську воду. Проте ці спроби часто давали не­задовільні результати, оскільки природні розріджувачі непостійні щодо складу, потребують старанної обробки і швидко псуються. Задовільні результати дало лише застосування молока. Значного поширення набули штучно виготовлені роз­чини (синтетичні середовища), спеціально призначені для розведення сперми того чи іншого виду тварин.

При розведенні сперми досягають такої мети:

1. Збільшення об'єму еякуляту, що дає можливість замінити  розріджувачем  значну частину сперми, яку вводять самці. Для тварин маткового типу природного осіменіння (коні, свині) збільшення об'єму сперми, що вводиться, підвищує запліднюваність самок. При осіменінні самок піхвового типу (корови, -вівці, кози) збільшення об'єму має суто технічне значення, даючи можливість поділяти еякулят на велику кількість доз і обійтися при цьому без введення доз дуже малого об'єму, що створило б значні технічні незручності.Так, виділюваний бугаєм за одну садку об'єм спер­ми, що дорівнює звичайно 4—6 мл, без розведення мож­на поділити не більш ніж на 10—20 доз (вводити коро­вам дози, менші за 0,3—0,5 мл, технічно важко). Розвівши той самий еякулят у 10—15 разів (звичайно, за умови, що сперма доброякісна), матимемо 40—90 мл розведеної сперми, яку можна використати для осіме­ніння 40—90 корів, вводячи їм по 1 мл, а при великому розведенні кількість осіменених корів може бути збіль­шена до 200—300.

2. Створення оптимальних умов для сперміїв частковою заміною плазми сперми розріджу­вачем, який містить глюкозу (або інші цукри) і цитрат натрію. Цукри є енергетичним матеріалом для сперміїв, а також охороняють їх від втрати електричного заряду. Цитрат натрію нейтралізує молочну кислоту та інші кис­лі продукти розпаду, зв'язує іони кальцію, які шкідливо діють на сперміїв. Крім того, цитрат натрію бере участь у процесі дихання сперміїв.

3. Підвищення стійкості сперміїв до швидкого охолодження і заморожування, що досягається введенням у розріджувач жовтка куря­чого яйця, гліцерину та інших речовин.

4. Гальмування обмінних процесів у сперміях, щоб подовжити строки зберігання їх. Цьо­го досягають введенням у розріджувач таких речовин, як двоокис вуглецю, органічні кислоти, хелатон.

5. Пригнічення розвитку бактеріальної флори у спермі, для чого у розріджувач вводять антибіотики.

У деяких випадках потрібно змінити   консистенцію сперми, зробивши її драглистою. У та­ких випадках до розріджувача додають желатину або якусь іншу речовину, що має подібні властивості.

Загальні вимоги до розріджувачів. Доброякісний розріджувач повинен забезпечити три­валу переживаність сперміїв і збереження ними заплід­нювальної здатності. Щоб відповідати цій основній умові, розріджувачі повинні задовольняти кілька за­гальних вимог.

По-перше, розріджувач повинен бути ізотонічним, тобто мати такий самий осмотичний тиск, як і у спермі того виду тварини, для якого він призначений. Концен­трацію цукрів, солей та інших розчинених у розріджу­вачі речовин добирають за допомогою розрахунків, а потім уточнюють спеціальними дослідами на спермі відповідного виду тварин.

Виготовляючи розріджувач, треба точно відважувати згадані в інструкції кількості речовин і не менш точно відмірювати дистильовану воду, в якій розчиняються ці речовини; інакше розріджувач не буде ізотонічним. Слід звернути особливу увагу на те, щоб реактиви, які вико­ристовуються при виготовленні розріджувача, були високоякісні і зберігалися в сухому місці в добре закри­тих банках. Реактиви, які відволожилися, застосовувати не можна, бо кількості увібраної ними води точно вра­хувати неможливо. Крім того, у вологих цукрах звичайно швидко розвивається мікрофлора, яка розкладає цукри, причому утворюються шкідливі для сперміїв продукти розпаду.

Деякі солі, що застосовуються для розріджувачів (наприклад, натрієві солі лимонної і фосфорної кислот), можуть мати різну кількість так званої кристалізаційної води, яка при неправильному зберіганні (у погано за­критій банці, що перебуває в дуже сухому місці) може частково втрачатися. Наявність у банці зруйнованих, побілілих кристалів, які втратили прозорість, свідчить про часткову втрату кристалізаційної води. При засто­суванні такої солі розріджувач не буде ізотонічним. Слід звертати особливу увагу на склад цитрату на­трію, який часто застосовується при виготовленні роз­ріджувачів. Для розріджувачів можна використовувати тільки тризаміщений цитрат натрію, що має солонува­то-лужний смак. Двозаміщений цитрат натрію (з їдким кислим смаком) застосовувати не можна. Оскільки у водопровідній і колодязній воді є розчинені речовини, склад і концентрація яких невідома, для виготовлення розріджувачів слід користуватися тільки дистильованою водою (а ще краще — бідистильованою).

Друга важлива вимога до розріджувачів полягає в тому, щоб речовини, які входять до складу їх, не дія­ли шкідливо на сперміїв. Не кажучи вже про "отруйні для сперміїв речовини (якими є, наприклад, солі важких металів — свинцю, олова та ін.), до розріджувача не рекомендується вводити хлористі солі, оскільки іон хло­ру руйнує ліпопротеїдний покрив спермія. Шкідлива дія властива також солям дво- і тривалентних металів, іони яких швидко нейтралізують електричний заряд сперміїв, внаслідок чого відбувається аглютинація останніх. Антибіотики, що вводяться у сперму, як правило, позитивно впливають на переживаність сперміїв. Проте деякі серії пеніциліну і стрептоміцину знижують жит­тєздатність сперміїв; тому слід спеціально перевірити, чи мають вони токсичні властивості.

Склад розріджувача повинен відповідати характер­ним особливостям сперми даного виду тварин. Так, для густої сперми барана і бугая, в якій швидко нагрома­джується молочна кислота, розріджувач повинен місти­ти буферні солі (цитрати, фосфати), що нейтралізують кислоту; для сперми жеребця вводити буферні сполуки немає потреби. Розріджувачі для сперми жеребця, як правило, не мають солей (оскільки їх без того багато у плазмі сперми) або містяться вони у незначній кілько­сті. Навпаки, вміст у розріджувачі цукрів значно поліп­шує переживаність сперміїв.

Цукри (глюкоза, сахароза, лактоза й особливо фруктоза), а також лецитин, що вводиться з жовтком, є для сперміїв енергетичним матеріалом, а тому вони входять до складу більшості розріджувачів. Рекомен­дується використовувати жовтки з яскраво-оранжевим забарвленням — це сприяє кращому зберіганню спер­міїв.

2.Санітарно-гігієнічні правила при розведенні сперми

Скляна посудина, в якій виготовляють розріджувач і проводять розведення, скляні палички для перемішу­вання сперми з розріджувачем і термометри для вимі­рювання температури розріджувача повинні бути абсо­лютно чистими і заздалегідь простерилізованими. Посу­дини з спермою і розріджувачем закривають кришками або марлевими серветками.

Розріджувач слід виготовляти безпосередньо перед взяттям і розведенням сперми (не раніше ніж за 2— 3 год). Якщо цей строк минув, треба виготовити свіжу порцію розріджувача, а залишки першої порції вилити, бо його властивості можуть змінюватися, зокрема при кімнатній температурі в ньому звичайно розвивається мікрофлора. Температура розріджувача в момент розведення по­винна дорівнювати температурі самої сперми. Холодний (порівняно зі спермою) розріджувач викликає холодовий удар сперміїв; при температурі розріджувача понад 40° може статися перегрів або навіть загибель сперміїв. При розведенні слід приливати розріджувач до спер­ми, а «е навпаки. Якщо лити сперму в розріджувач, то перші порції сперміїв потрапляють в умови дуже вели­кого розведення. Оскільки розріджувач, навіть найкра­щий, не призначений для таких великих ступенів розве­дення, спермії можуть загинути.

Техніка виготовлення розріджувачів. На станціях штучного осіменіння слід відважувати сухі реактиви для виготовлення розріджувачів заздалегідь; якщо сперму від плідників беруть вранці, то наважки виготовляють напередодні увечері.

Глюкозу, цитрат натрію та інші порошкоподібні реак­тиви відважують на аналітичній або аптечній (роговій) вазі. Реактиви насипають роговою ложечкою; після взят­тя кожного з реактивів старанно обтирають її ватою, щоб виключити потрапляння одного реактиву в банку з іншим.

Добирають флакони з антибіотиками, що містять по­трібну кількість одиниць дії (ОД), і висипають весь вміст флаконів у колбу або банку з наважками інших реактивів. Так, на 1 л глюкозо-цитратно-жовткового роз­ріджувача треба вносити 750—1000 тис. ОД пеніциліну. Отже, потрібно взяти вміст десяти флаконів пеніциліну, на етикетці яких зазначено: «100 тис. ОД», або три фла­кони по 300 тис. ОД, або два флакони по 500 тис. ОД.

Якщо потрібно виготовити меншу кількість розрі­джувача, то слід визначити зважуванням, скільки ва­жить порошок антибіотика у флаконі, і потім обчислити, в якій наважці міститиметься необхідна кількість одиниць дії. Якщо до розріджувача вводять стрептоцид, який по­гано розчиняється у воді кімнатної температури, то його слід відважувати в окрему чисту банку, в яку вливають, при остаточному виготовленні розріджувача повний об'єм дистильованої води, що належить за рецептом, і нагрівають банку на водяній бані при температурі 90°, помішуючи скляною паличкою до повного розчинення стрептоциду. Потім охолоджують розчин до З0—35° і ви­ливають його в банку, де містяться наважки з іншими реактивами й антибіотиками. Нагрівати повністю виго­товлений розріджувач до температури понад 40° ні в яко­му разі не можна, оскільки це призводить до інактивації пеніциліну та стрептоміцину і до коагуляції жовтка.Тепер промисловість випускає препарат спермосан, який містить усі бактеріостатичні речовини у по­трібному співвідношенні. Після повного розчинення всіх реактивів (щоб це при­скорити, розріджувач помішують стерильною паличкою) додають потрібну кількість жовтка і знову перемішують розріджувач.

Свіжі курячі яйця (від здорових курей), що застосо­вуються для взяття жовтка, слід обтерти тампоном, змо­ченим 96°-ним Спиртом-ректифікатом. Потім розбивають навпіл шкаралупу простерилізованим скальпелем, ста­ранно зливши білок в окрему банку, перекладають жов­ток на фільтрувальний папір, щоб осушити його від за­лишків білка, проколюють оболонку жовтка стерильним скальпелем і зливають рідкий жовток  (без оболонки) у стерильну мензурку. При виготовленні великої кіль­кості   розріджувача беруть відповідну кількість яєць (жовток середньої величини має в об'ємі 12—15 мл).

Банку або колбу з виготовленим розріджувачем за­кривають кришкою або пробкою і ставлять у посудину з теплою водою (30—35° для сперми бугая, жеребця і кнура і 25—30° для сперми барана).

3. Біоконтроль і фарбування

Біоконтроль розріджувачів. Перед тим як застосову­вати для виробничих цілей розріджувач, який раніше не використовувався на станції або пункті, необхідно перевірити його якість біологічним способом на переживаність у ньому сперміїв. Таку перевірку слід практикувати і на початку використання кожної нової банки з глюко­зою або іншими реактивом, що входить до складу розрі­джувача, нової партії антибіотиків, а також після ремон­ту перегінних кубів для добування дистильованої води.  Біоконтроль виконують так. В 11 чисто вимитих, ви­сушених і простерилізованих у сушильній шафі пробірок наливають по 0,5 мл розріджувача. У першу пробірку вносять за допомогою градуйованої пінетки 0,5 мл добро­якісної сперми відповідного виду тварин, старанно пере­мішують з розріджувачем і такий самий об'єм суміші переносять у другу пробірку, знову перемішують і т. ін.

Виходить послідовний ряд розріджень сперми у 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 і 1024 рази. Пробірки щільно закривають гумовими пробками (так, щоб гума не стикалася зі спермою) і зберігають при температурах від 0 до 5° (сперму кнура при 10°). Один раз на добу беруть з кожної пробірки краплю (попередньо перемі­шавши вміст пробірки) і визначають під мікроскопом у термостаті з температурою 39—40° активність сперміїв.

Після загибелі (або зниження активності до 1 балу) сперміїв в усіх пробірках обчислюють абсолютні по­казники переживаності (див. розділ 6) для кожного роз­ведення. Таким способом визначають оптимальне роз­ведення і тривалість зберігання сперміями так званої виробничої (тобто допустимої при осіменінні самок) активності.

Фарбування сперми. При перевезенні флакони зі спермою окремих плідників можуть бути випадково переплу­тані внаслідок втрати етикеток або стирання написів. Щоб запобігти таким випадкам, Стрєлков і Родін реко­мендують додавати до сперми харчові синтетичні барв­ники: індиго (синя), амарант (червона), тартразин і нафтоль-гельб (обидві жовті).

Розчиняють 0,1 г фарби у 3% розчині тризаміщеного цитрату натрію; 0,1 — 0,3 мл цього розчину додають до 100 мл розріджувача. Кожен колір означає певну породу або лінію плідників, про що станція заздалегідь повідом­ляє працівників пунктів штучного осіменіння  

Ступінь розведення сперми. Ступінь розведення сперми визначається видом плід­ника і якістю сперми, а також потребою у розведеній спермі на пунктах штучного осіменіння. Чим вища кон­центрація й активність сперміїв, тим більшу ступінь роз­ведення можна застосувати.Сперму баранів розводять у 2—4 рази (відношення об'єму сперми до об'єму розріджувача від 1 : 1 до 1 : 3). Спроби застосу­вати більші ступені розведення досі були невдалими: незважаючи на добру активність і переживаність сперміїв, запліднюваність овець різко спадала. Причини цього поки що не з'ясовані. Ви­словлювалися припущення, що зниження запліднюваності може бути внаслідок витікання розведе­ної сперми, в якої низька в'яз­кість, з шийки матки в піхву.У дозі, потрібній для осіме­ніння однієї вівці (0,1—0,15 мл), повинно міститися 75—100 млн. активних сперміїв.

Сперму бугаїв   розводять у 10-40 разів (від 1:9 до 1:39), а в деяких випадках застосовують і більші ступені розведення. При розрахунках виходять з нормативу: ,в 1 мл розведеної сперми повинно містити­ся 25—50 млн. сперміїв, які рухаються прямолінійно.

Сперму кнурів розводять в 2—6 разів (від 1:1 до 1:5), а сперму жеребців — в 2—4 рази (від 1:1 до 1:3). При штучному осіменінні свиней застосовують два види розріджувачів: а) розріджувачі, призначені для розведення і зберігання сперми поза організмом, і б) розріджувачі-заповнювачі, застосовувані при фракційному способі осіменіння свиней. В останньому разі у статеві органи свині спочатку вводять розведену сперму, а слідом за нею — заповнювач, який проштовхує сперму у глибину рогів матки.